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  本研讨构建了断合同位素示踪与高通量剖析的动态单细胞代谢组学体系，经过MDA-MB-231细胞代谢活性剖析、代谢通路流解析、药物扰动验证及肿瘤-巨噬细胞互作研讨。

  代谢重编程是肿瘤发生开展的中心特征，肿瘤微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞的代谢互作调控二者表型与功用，但其单细胞水平的动态代谢沟通机制没有清楚。传统代谢组学仅能静态检测代谢物浓度，无法反映代谢通路的实在活性；单细胞代谢剖析与安稳同位素示踪技能的结合虽为解析单细胞代谢动态供给了或许，却受限于高通量检测技能短板与精准数据解析瓶颈，且惯例共培育剖析的别离或符号操作易搅扰细胞天然代谢状况，难以精准解析二者直接的代谢互作，一起肿瘤相关巨噬细胞的极化异质性也缺少根据代谢特征的单细胞分型办法。本研讨构建高通量、无符号的单细胞动态代谢组学剖析体系，结合安稳同位素示踪与机器学习技能，从静态浓度和动态活性双维度解析肿瘤细胞与巨噬细胞的直接代谢互作规则，提醒肿瘤微环境的代谢调控机制并完成肿瘤相关巨噬细胞的代谢特征精准分型。

  研讨人员根据适用于集体体系的MetTracer大局同位素示踪技能，构建了单细胞同位素示踪剖析流程（图2a）。体系全体作业流程如图1所示：细胞经同位素示踪剂符号后，由高通量数据收集渠道（如有机质谱流式设备）剖析，再经过根据Python的数据处理平成单细胞根本代谢数据处理和同位素示踪剖析，完成了单细胞水平代谢活性谱剖析、交织代谢网络流向剖析及细胞间相互作用研讨。

  要害数据处理过程包含单细胞脉冲峰挑选、特征峰确认、代谢物注释及峰强度提取。在该数据收集条件下，经过总离子流(TIC)改变和细胞标志物的提取离子流(EIC)可见，一个单细胞脉冲含3-6个质谱图（图2b），这与细胞体积有关，而代谢物差异或许源于细胞内浓度及鞘液提取功率。

  对10个细胞脉冲中特征峰的最大强度保存时刻剖析显现，大都峰在细胞脉冲内两个相邻质谱图（距离135ms）即r1和r2处达最大强度（图2c-d）。其间，m/z 80-500的峰倾向于在r1达峰，m/z 500-1000的峰更或许在r2达峰，这与不同巨细分子的电搬迁速率共同。

  别离根据m/z 306.0760（谷胱甘肽）、m/z 804.5760（磷脂酰丝氨酸（37:0））及每个细胞脉冲最大强度提取的单细胞代谢物强度热图，出现出显着不同的代谢谱（图2e），且经过两种不同分子量细胞标志物确认的代谢物比仅用一种更多（图2f）。

  此外，核算每个检测峰的信号布景比(SBR)，仅保存SBR3且在一切细胞中出现频率20%的峰作为细胞特征峰，为后续剖析奠定根底。

  为验证体系作用，研讨人员以MDA-MB-231细胞为模型做多元化的剖析（图3a）。细胞在含透析胎牛血清(dFBS)的培育基中培育，别离用[U-¹³C]-葡萄糖和[U-¹³C]-谷氨酰胺符号5分钟至3小时，经优化后，3小时内共符号出40种代谢物（图3b）。KEGG富集剖析显现，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物组成、三羧酸循环、嘌呤代谢等通路易被该办法符号和检测（图3c）。

  在两种同位素符号条件下，符号代谢物被层次聚类为3个簇（图3d），并出现出不同的时刻进程形式：簇1的代谢物在3小时内到达同位素稳态，符号速率最高；簇2和簇3的代谢物3小时内未达稳态，符号速率顺次下降（图3e-f）。经过非线性拟合核算各代谢物的符号速率(k)，发现3个簇中代谢物的符号速率与时刻进程形式共同（图3g-h），且这一成果在KEGG通路注释中得到验证（如葡萄糖符号下，半乳糖代谢和鞘脂代谢的符号速率较高；谷氨酰胺符号下，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢的符号速率较高，图3i-j）。

  对约5000个经[U-¹³C]-葡萄糖符号的单细胞（包含6个符号时刻点）做多元化的剖析，根据符号程度(LE)特征的UMAP剖析识别出单细胞亚群（图4a）。经过密度聚类算法(DBSCAN)对一切细胞做多元化的剖析，得到A、B、C、D、E、F六个聚类（图4b），且各符号代谢物的LE从A到F顺次升高，标明聚类A-F随符号时刻呈演化趋势。不一起间组的单细胞在亚群中的散布存在差异（图4c），如5分钟、10分钟、30分钟、1小时和3小时组均包含多个亚群。这些成果提醒了代谢活动的异质性及单细胞在符号时刻上的非同步性，这是传统批量剖析无法捕捉的。

  以[U-¹³C]-葡萄糖为示踪剂，UDP-葡萄糖的M6同位素体显现其己糖部分经过糖酵解中心产品葡萄糖-1-磷酸在5分钟内快速符号（图5a）；M5符号核糖经磷酸戊糖途径和嘧啶代谢生成，使UDP-葡萄糖的M11同位素体在1小时后出现，而M6符号程度在3小时后显着下降（图5b）。此外，三羧酸循环代谢物检测到多种符号同位素体（图5c），相关代谢物也出现与循环阶段对应的符号形式（图5d）。

  3小时符号样本的相关性矩阵剖析提醒了单细胞通路间的相关（图5e-f）。仅用[U-¹³C]-乳酸示踪时，观察到M2符号的UDP-葡萄糖（图5g），且[U-¹³C]-乳酸未发生符号尿苷，标明其源于糖异生途径的己糖符号（图5h）。以[U-¹³C]-谷氨酰胺为示踪剂时，A549细胞中M3符号的苹果酸和天冬氨酸符号程度显着高于MDA-MB-231细胞，显现其复原活性更高（图5j）。

  研讨人员比较了对照与2-脱氧葡萄糖(2-DG)处理条件下MDA-MB-231单细胞的代谢动态。2-DG经过按捺己糖激酶阻断糖酵解，生成2-DG-6P，处理组单细胞中可检测到该物质，且细胞形状和生机正常。

  浓度剖析显现，不同处理时刻的2-DG组与对照组存在十分显着差异代谢物，触及氨基糖代谢、嘌呤代谢等通路，部分代谢物（如PE、SM、谷氨酰胺）在3小时处理后浓度升高，或许是应对糖酵解按捺的前期机制。

  动态剖析中，UDP-葡萄糖/UDP-半乳糖的丰度无显着改变，但经[U-¹³C]-葡萄糖符号1小时后，其LE下降，标明糖酵解活性下降（图6a）；UDP-GlcNAc的丰度在3小时处理后不变、过夜后下降，而其LE在两处理组均显着下降（图6b），且两种代谢物的符号速率在2-DG处理后下降（图6c-d），表现LE对短期代谢活性改变的活络反映。

  层次聚类将符号代谢物分为两簇：簇1的LE下降，触及糖酵解相关通路；簇2的LE升高，包含TCA循环等代替能量途径，且这些代谢物浓度均下调或无显着改变（图6e-f）。

  降维剖析显现，根据相对强度难以区别三组单细胞，结合LE可根据活性水平有用区别，而将代谢物相对强度与LE结合，区别作用更优（图6g-h），标明动态代谢组学是浓度剖析的必要弥补。

  研讨人员使用该体系剖析MDA-MB-231肿瘤细胞与THP-1来历巨噬细胞的共培育体系，共培育细胞经UMAP剖析分为两个簇（CD45⁺巨噬细胞与CD45⁻肿瘤细胞，图7a）。为精准分类细胞，开发了根据神经网络的监督机器学习模型（图7b），练习后验证准确率达 98.5%（图7c），能牢靠区别两类细胞。

  代谢活性剖析显现，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)与独自培育的巨噬细胞比较，氧化磷酸化、三羧酸循环等通路活性显着改变，且与浓度剖析成果共同（图7g）。共培育的肿瘤细胞也出现代谢适应性改变。

  TAM中氧化磷酸化、三羧酸循环相关代谢物活性十分显着升高（图7h-i），而丰度无显着差异；UDP-GlcNAc丰度添加但代谢活性略降（图7j），提示其堆集或许因耗费削减。

  本研讨构建了断合同位素示踪与高通量剖析的动态单细胞代谢组学体系，经过MDA-MB-231细胞代谢活性剖析、代谢通路流解析、药物扰动验证及肿瘤-巨噬细胞互作研讨，多维度证明其有用性。该体系打破传统批量剖析限制，经过符号程度(LE)与浓度数据结合，完成从静态浓度到动态功用的解析，为细胞异质性研讨、疾病模型构建及精准医治供给了技能支撑与理论按照。